本文是学习GB-T 33122-2016 花园葱蜗牛检疫鉴定方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了花园葱蜗牛 Cepaea hortensis(Muller,1774) 的检疫鉴定方法。
本标准适用于花园葱蜗牛的检疫鉴定。
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SN/T 3067 软体动物常规检疫规范
SN/T 3067界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1
生殖器 genitalia
蜗牛的交配和繁殖器官。
注:雄性生殖器主要包括输精管、阴茎、阴茎本体、阴茎牵引肌、鞭状体等部分,雌性生殖器主要包括矢囊、副矢囊、
恋矢、黏液腺、受精囊、受精囊柄、盲管等部分。
3.2
鞭状体 flagellum
蜗牛雄性生殖系统中的附器,由阴茎本体末端分支形成。
3.3
盲管 diverticulum
由受精囊柄分支形成的管状结构。
注:盲管为大蜗牛科 Helicidae的基本特征。
3.4
矢囊 dart sack
蜗牛雌性生殖系统中一个藏有1枚或多枚骨针的肌肉质的囊状结构。
3.5
恋矢 Love dart
矢囊中钙质或壳质的骨针,为蜗牛交配时刺激器官。
注:恋矢的质地和形状常用于分类。
3.6
壳口 aperture
贝壳开口部位,为蜗牛头和腹足的出口。
注:壳口的边缘为口唇,按其在壳口中的位置不同可分为内唇、外唇、轴唇、基唇、上唇和下唇。
GB/T 33122—2016
学名:Cepaea hortensis(Muller,1774)。
异名:Helix hortensis Muller,1774。
英文名:White-lipped banded snail,White-lipped grove
snail,White-lipped garden snail。
分类地位:软体动物门 Mollusca,腹足纲 Gastropoda, 柄眼目 Stylommatophora,
大蜗牛科 Helicidae,葱蜗牛属Cepaea Held,1837。
花园葱蜗牛的近似种有森林葱蜗牛 C.nemoralis(Linnaeus,
1758)、维也纳葱蜗牛 C. vindobonensis(Pfeiffer,1828)。
花园葱蜗牛昼伏夜出,常隐藏在人们难以发现的地方,易于传播。其传播特点是不需要特定的寄
主,凡接触过地面的物品都可能传播。传播方式和传播途径是确定现场检疫方式的依据。贝壳形态、软
体解剖和分子特征是实验室鉴定的主要依据。
体视显微镜、放大镜、手电筒、塑料自封袋、广口标本瓶、4 mm
孔径土壤筛、小铁铲、游标卡尺、搪瓷 盘、培养皿、解剖针(直径0.15 mm)、
镊子、剪刀、小剪刀、显微镊子、显微剪刀、解剖腊盘、标签、移液枪、
微型离心机、PCR 仪、1.5 mL 离心管、0.2 mL PCR反应管、恒温金属浴。
除另有规定外,所有试剂均为分析纯。
75%乙醇、无水乙醇、硫酸镁、动物基因组DNA 提取试剂盒、PCR
反应液、ddH₂O。
对来自疫区(参见附录 A)
的运输工具和货物实施重点查验。仔细检查运输工具、木质包装物、未经
加工的植物性材料、苗木、花卉、盆景、废塑料等是否有蜗牛附着其上,花园葱蜗牛昼伏夜出,尤其要注意
阴暗蔽光处的检查,用手电筒仔细寻找蜗牛的行迹。蜗牛爬行过后,会留下银灰色的丝带状黏液痕迹,
这是判定是否有蜗牛污染的重要依据。发现蜗牛,随时装入塑料自封袋或标本瓶,带回实验室做进一步
的检验鉴定。发现盆景等携带土壤或其他细碎衬垫材料时,需过筛检查是否有卵或幼螺。
用游标卡尺测量蜗牛贝壳的壳高和壳宽、卵粒长和宽。用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵
和螺的形态特征。
将闷杀(见10.1)处理后的标本,参照 SN/T 3067解剖软体,分离出生殖系统。
GB/T 33122—2016
8.2 葱蜗牛属Cepaea Held,1837 鉴定特征
贝壳无脐孔,圆球形或稍压扁,
一般具有5条黑褐色的色带,但也有完全无色带的个体。有5个螺
层,最后一个螺层向下倾斜。壳口倾斜,口缘宽大且内增厚,下缘直。颚片粗壮,具有4条~6条粗肋,
齿舌的中央齿和侧齿无齿尖。恋矢有时具有4条裂脊,黏液腺具有一显著长的分支。受精囊柄很长,分
支形成盲管,阴茎具有长的鞭状体。
8.3 花园葱蜗牛Cepaea hortensis(Miller,1774)鉴定特征
卵圆形,白色,短径2 mm, 长径2.5 mm。
8.3.2.1 成 螺
贝壳扁球形,缓慢膨胀,style="width:1.60667in;height:0.59334in" />个螺层,脐孔完全被唇缘覆盖。壳口"U"
形,口唇白色粗短,偶
而有褐色,外唇向外延伸反折,内唇贴覆于体螺层上,形成一薄的白色胼胝部。贝壳色彩明亮,有光泽,
其上有微弱而不规则的生长嵴和螺旋状的色带0条~5条,故也称白唇彩带蜗牛。贝壳在颜色和色带
数 量 方 面 变 异 很 大 。 极 少 数 口 唇 是 褐 色 的 个 体 , 在 形
态 上 很 像 森 林 葱 蜗 牛 Cepaea nemoralis
(Linnaeus,1758),
但本种贝壳更细薄一些,螺层更圆滑一些,尺度更小一些。壳高10 mm~15
mm,壳
宽14 mm~20 mm 。参见附录 B 中 图 B. 1:A 、B 、C。
8.3.2.2 幼 螺
幼螺贝壳在外部形态上与成螺无多大差异,只是个体小,壳质薄,口缘外唇不向外延伸扩展。
腹足肌肉发达,通常呈灰绿色,头部棕色,从触角基部中央到颈部之间有一条浅色的线条。蜗牛爬
行时其软体伸展长度可达3.5 cm~4.2 cm 。参 见 图 B. 1:D。
阴茎长,阴茎本体与阴茎差不多等长,阴茎本体略带紫色。鞭状体细长。阴茎牵引肌薄而宽,中等
长度。受精囊柄长,略粗。矢囊大,椭圆形,无副矢囊。黏液腺两枝,分别长在阴道两侧,每枝二分叉,分
叉后每枝又分2枝~3枝,即一枝黏液腺有4个~6个分支,而森林葱蜗牛最多只有3个分支;黏液腺管
状,粗实且长,光滑。阴道呈明显的紫色。参见图B.2。
按附录 C 方法提取 DNA 、PCR
扩增和双向测序,将所测序列与已知花园葱蜗牛的 COI 基 因 序 列
(Genbank 登录号为 KF596879.2) 进行比对,相似度一般应≥96%。参见附录C。
以贝壳形态为基本鉴定依据,螺体和外生殖器解剖形态为辅助鉴定特征,并注意与近似种鉴别(参
见附录 D),
对于口唇为白色的个体,符合8.3.2或同时符合8.3.2、8.3.3、8.3.4
形态特征的蜗牛鉴定为花
GB/T 33122—2016
园葱蜗牛 Cepaea
hortensis(Müller,1774);对于口唇为褐色的个体,应同时符合8.3.2、8.3.3、8.3.4形
态特征的蜗牛才鉴定为花园葱蜗牛 C.hortensis(Muller,1774)。
单独查获的卵粒符合8.3.1形态特 征,应通过孵化和饲养实验(参见SN/T
3067),做进一步的鉴定。符合8.3.5作为前期初筛或最终鉴定
结果的分子佐证。
将蜗牛置于盛满水的瓶中,盖上瓶盖,进行闷杀,蜗牛在慢慢窒息的死亡过程中,逐渐伸展身体;或
逐渐加入少量硫酸镁,进行麻醉闷杀。
将闷杀后伸展的蜗牛标本置于无水乙醇中浸泡1 d~2d,
然后在75%乙醇溶液中固定,每隔1 d~ 2d
换1次乙醇溶液,共换3次~4次,便可长期保存于75%乙醇溶液中。解剖后的生殖系统可直接保
存于75%乙醇溶液中。
经处理后的标本,至少妥善保存6个月,并注明时间、产地、寄主、采集人等信息。
GB/T 33122—2016
(资料性附录)
花园葱蜗牛寄主、地理分布及其他信息
A.1 寄主植物
杂食性。幼螺以腐殖质、植物的幼苗和嫩芽为食;成螺取食各种绿色植物的茎和叶。
A.2 地理分布
欧洲:中欧、西欧、北欧、冰岛地区。具体分布的国家包括英国、德国、法国、荷兰、卢森堡、比利时、波
兰、瑞典、挪威、芬兰、冰岛、拉脱维亚、爱沙尼亚、乌克兰(西部)、俄罗斯(加里宁格勒)、白俄罗斯(维帖布
斯克)。
北美洲:美国(东部)、加拿大。
A.3 生物学习性与危害性
花园葱蜗牛Cepaea
hortensis(Muller,1774)是我国颁布的进境植物检疫性有害生物。该螺昼伏
夜出,常藏匿于阴暗处,可以休眠方式随货物和木质包装材料远距离传播。花园葱蜗牛为农业生产上的
重要有害生物,不但可直接危害各种蔬菜、瓜果、花卉和农作物,而且也是许多人畜共患寄生虫的中间宿
主,影响人畜健康。如在西欧的黑醋栗收获期间,这种蜗牛平时歇息在灌木丛中,这时会爬到果盆、果箱
中歇息,不但给田间生产造成直接危害,而且经常在运输过程中严重污染果品,导致工厂拒绝收货,造成
重大经济损失。近年来,我国江苏、张家港、浙江、宁波、福建、天津、山东、广东、上海等口岸多次从进境
植物检疫中截获该蜗牛,表明该螺的传入风险较高。
GB/T 33122—2016
(资料性附录)
花园葱蜗牛形态及生殖系统特征
花园葱蜗牛形态及生殖系统特征见图 B.1 和 图 B.2。
style="width:10.28661in;height:12.95998in" />
说明:
A、B、C 贝壳形态;
A — 侧面观;
B —— 背面观;
C —— 腹面观;
D —— 蜗牛爬行时外部形态。
图 B.1 花园葱蜗牛形态特征
GB/T 33122—2016
说 明 :
—
—
F
PR —
VD —
—
MG-
PBC—
BC —
D
style="width:9.09324in;height:9.49908in" />
阴茎 ;
阴茎本体;
鞭状体;
阴茎牵引肌;
输精管;
矢囊 ;
黏液腺;
受精囊柄;
受精囊;
盲管。
注:标本产地:芬兰。
图 B.2 花园葱蜗牛生殖系统特征
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(资料性附录)
花园葱蜗牛COI 基因辅助鉴定方法
C.1 DNA 提 取
取适量腹足肌肉,用SDS 方法或动物基因组 DNA 试剂盒方法提取DNA。
C.2 COI 基因引物
LCO1490:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3'
HCO2198:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'
C.3 反应体系
反应体系为20μL:其中DNA 模板2μL,LCO1490(10 μmol/L)0.5μL,HCO2198(10
μmol/L)
0.5μL,2×Master Mix 10μL,ddH2O7μL。
C.4 PCR 扩增条件
94℃ 5 min;94℃ 50 s,45℃30 s,72℃ 50 s,30个~35个循环;72℃ 10 min,4℃。
C.5 测序
将PCR 扩增样品送有资质的生物技术公司测序。
C.6 比对鉴定
将双向测序获得的600 bp~700 bp长度 DNA
序列片段,经软件拼接和人工校对后,与已知花园葱 蜗牛的 COI
基因序列(Genbank 脊录号为 KF596879.2)
讲行比对,相似度≥96%的待鉴样品确定为花
园葱蜗牛的疑似样品。
GB/T 33122—2016
(资料性附录)
花园葱蜗牛与近似种的鉴别特征比较
表 D. 1 花园葱蜗牛与近似种鉴别特征比较
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